Enzimas de restricción:
Introducción:Las enzimas de restricción se encuentran en muchas especies de bacterias. Este sistema es análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su DNA y el DNA exógeno. El DNA exógeno está último degradado por la enzima de restricción. El DNA propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas).
Un virus de bacteria (un fago) capaz de propagarse en una cepa bacteriana determinada no se replica cuando es cultivado en una cepa diferente. Casi siempre una pequeña proporción del fago es capaz de evadir este estado de restricción y crecer de manera adecuada en la nueva cepa bacteriana.
La progenie de este fago será incapaz de crecer en la cepa bacteriana que originalmente permitió la propagación del fago precursor. Estas observaciones sugieren que una modificación específica inducida por la nueva bacteria hospedera protege al fago de manera que no puede ser restringido dentro de la nueva cepa bacteriana, pero a la vez pierde la capacidad para crecer en la antigua cepa hospedera.
La modificación inducida por el hospedero ocurre en el nivel del ADN del fago, y el fenómeno de restricción es consecuencia de la degradación por hidrólisis enzimática del ADN viral que no ha sido modificado.
Tipos de enzimas de restricción
Tipo I
Una sola enzima que posee 3 subunidades reconoce el sitio de ADN¿ Esta enzima metila y restringe. La restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.
Tipo II
Dos enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos.
Tipo III
Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 bp, más allá del sitio de reconocimiento.
Endonucleasas de restricción tipo II
Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.
Se han identificado más de 2300 endonucleasas de restricción de tipo II. Se denominan Isomeros a aquellas enzimas que han sido obtenidas de diferentes especies de bacterias, pero que reconocen la misma secuencia de DNA.
Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes:
A. Cortes pegajosos, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej:Eco RI y Pst I
Cortes simétricos, dejando productos con extremos romosEj: Pvu II
Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos ciegos y con extremos escalonados), en ingeniería genética se prefieren aquellos con extremos complementarios, puesto que permiten la unión espontánea del gen a clonar con el vector. Si las moléculas a utilizar presentan extremos ciegos, hay que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando la enzima transferasa terminal.
Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda). La nomenclatura que se sigue para designar las enzimas de restricción es son las siguientes:
Talla de los fragmentos de restricción:
Si los sitios de restricción fueran distribuidos al azar en la longitud de una molécula de ADN, una enzima que reconocería una secuencia de 4 nucleótidos, cortaría 1/256 nucleótidos, mientras que una enzima que reconocería 6 nucleótidos cortaría en promedio 1/4.096 nucleótidos.
La digestión por EcoRI (secuencia de reconocimiento de 6 nucleótidos) de una molécula de ADN bacteriano de 4 millones de pares de bases donará alrededor 10000 fragmentos diferentes, mientras que la digestión total de ADN de un mamífero va a producir alrededor de 10000000 fragmentos.
Plasmidos
Son moléculas de ADN circular o lineal de 1 kb a 250 kb, contienen de 2 hasta 30 genes. Los plásmidos se replican y se transmiten independientemente del cromosoma bacteriano. La replicación y la transcripción de los plásmidos dependen de las proteínas de la célula huésped. Los genes codificados por los plásmidos le donan ciertos privilegios a la célula huésped.
El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Los plásmidos se utilizan en ingeniería genética por la facilidad con la que se manipulan. Los plásmidos usados en Ingeniería Genética contienen uno o dos genes que les confieren resistencia a antibióticos (marcadores selección) y permiten seleccionar clones recombinantes
Un plasmido debe contener ciertas secuencias necesarias para poder ser utilizados en biotecnología:
Un origen de replicación (ori): par que el plasmido pueda replicarse y generar copias de si mismo en las células hijas.
Gen de resistencia a antibiótico (Amp): en el esquema se muestra como amp porque es un gen de resistencia a la ampicilina, pero podría ser una gen de resistencia a cualquier antibiótico, esto permite seleccionar las bacterias que incorporaron el plasmido.
Polylinker: en castellano la traducción seria el multienlazador, es una región de ADN diseñada para contener varias secuencias de cortes para diferentes enzimas de restricción, donde se podrá insertar el ADN que se desee.
Acá tienen un vídeo, un poco triste porque no tiene audio sobre la estructura de los plasmidos y como se utilizan para transformar bacterias
